传统酱菜中降解亚硝酸盐枯草芽孢杆菌筛选和鉴

分类：论文范文 发表时间：2021-05-27 10:29

　　摘要：酱菜是我国传统风味的调味佳品，但在酱菜的生产过程中易产生大量的亚硝酸盐，因此从酱菜中分离、筛选出能降解亚硝酸盐的高效菌株尤为重要。本实验利用传统分离纯化方法从酱菜中筛选出的能高效降解亚硝酸盐的菌种，并通过现代分子生物学鉴定方法对其进行分析。结果表明，该筛选出的菌株具有一定的降解亚硝酸盐能力，通过分子生物学鉴定为枯草芽孢杆菌。研究为酱菜生产提供优质菌种资源奠定了一定的基础。

　　关键词：酱菜；亚硝酸盐；枯草芽孢杆菌

　　酱菜是以新鲜的蔬菜，经食盐腌渍成咸菜坯，用压榨或用清水浸泡以降低盐度的方法，然后再用不同的酱或酱油进行酱制，使酱中的糖分、氨基酸、芳香物质等渗入到咸菜坯中，成为味道鲜美、营养丰富、开胃增食及容易保存的酱菜[1]。酱菜中含有一定的亚硝酸盐，微生物降解是减小亚硝酸盐含量的一种有效手段。目前，应用于食品中降解亚硝酸盐的细菌主要是乳杆菌，已经报道的菌株有干酪乳杆菌鼠李糖亚种（Lactobacilluscaseisubsp.rhamnosus6013，LCR6013）、植物乳杆菌（Lactobacillusplantarum）、短乳杆菌（Lactobacillusbrevis）等[2]，除此之外还可利用亚硝酸盐还原酶进行亚硝酸盐的生物降解，但目前还没有很好的办法得到大量的食用安全的亚硝酸盐还原酶，因此筛选活性好、降解率高的降解菌株就显得尤为重要。本次研究从酱菜中筛选出一株芽孢杆菌，经分子生物学鉴定为枯草芽孢杆菌，枯草芽孢杆菌是农业上生防农业病虫害的重要生防菌之一[3]，不仅在饲料中应用比较广泛，在污水处理及生物肥发酵或发酵床制作中应用也相当广泛，同时也是一种可帮助消化的消化道益生菌，是一种多功能的微生物。本文旨在将通过传统筛选方法，筛选出目标菌株，并对目标菌株进行初步鉴定，为酱菜生产提供优质菌种资源，降低酱菜生产中的亚硝酸盐含量，完善酱菜工业化生产。

　　1材料与方法

　　1.1材料与试剂

　　样品为济宁市售的本地酱菜。蒸馏水、生理盐水、医用酒精棉球、碘单质、95%的乙醇溶液、甘油、可溶性淀粉、LB肉汤及琼脂。

　　1.2培养基

　　LB肉汤固体培养基：胰蛋白胨10g，琼脂20g，酵母提取物5g，氯化钠10g，蒸馏水1000mL，PH7.0；LB液体培养基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，蒸馏水1000mL，pH7.0。

　　2结果与分析

　　2.1枯草芽孢杆菌的分离

　　提取碾碎酱菜上清液，在EP管中配制成不同浓度菌液，并把其涂布在固体培养基中培养，稀释浓度越高，菌落数量越高（见图1）；进行形态学观察，对其中长势较好的菌落进行镜检（见表1）。革兰氏染色后枯草芽孢杆菌被染成了蓝紫色[5]，证明枯草芽孢杆菌是革兰氏阳性菌（见图2）。从平板中LB固体培养基上反复纯化筛选，最终挑选出单菌落最大的3株。将筛选到的菌株编号为JBA-1、JBA-2、JBA-3，接种到液体培养基中，筛选得到枯草芽孢杆菌。

　　2.2降解亚硝酸盐枯草芽孢杆菌的鉴定

　　2.2.1降解亚硝酸盐的鉴定实验

　　用挑选出JBA-1A、JBA-1B、JBA-1C，JBA-2A、JBA-2B、JBA-2C、JBA-3A、JBA-3B和JBA-3C号枯草芽孢杆菌降解亚硝酸盐，随着时间变化，跟空白对照相比，容量瓶中亚硝酸钠含量均减少。由表2可知，在同一时刻，加入不同枯草芽孢杆菌的容量瓶中亚硝酸钠含量也有差别。3-1、3-2、3-3号容量瓶中亚硝酸钠含量最低，证明JBA-3对亚硝酸钠分解能力最强。将1号菌株取名为JBA-3枯草芽孢杆菌菌，分离提取置于EP管中冰冻保存（加甘油，防止冻坏）。

　　2.2.2降解亚硝酸盐枯草芽孢杆菌的分子生物学鉴定

　　将菌株对JBA-3的16SrDNA序列结果在NCBI进行Blast相似性比对，选取同源性较高的枯草芽孢杆菌，以邻接法构建系统发育树。比对结果显示出与枯草芽孢杆菌168同源相似性高达99.9%，因此该菌株鉴定为枯草芽孢杆菌。

　　3结论与讨论

　　本次实验成功的从酱菜中提取到了枯草芽孢杆菌，并对其进行了形态学研究。根据《食品安全标准食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定》（GB5009.33—2016）中的盐酸萘乙二胺法筛选出了降解亚硝酸盐能力较强的优良菌株JBA-3枯草芽孢杆菌。从济宁地区酱菜中提取到了枯草芽孢杆菌[6]，表明当地生产的酱菜中亚硝酸盐含量可能较低，对人体危害程度较低。将筛选出的JBA-3枯草芽孢杆菌应用到酱菜的生产过程中，可提高酱菜口感风味，并减少亚硝酸盐含量，减少酱菜的腌制时间，提高经济效益。也可将JBA-3枯草芽孢杆菌应用于生产生活中的其他方面，如筛选新型抗菌脂肽、高活力蛋白酶等。

　　参考文献

　　[1]傅亮，鲍玲玲，吴炳鸿，等.豆类多肽对酱菜发酵中亚硝酸盐降解影响的研究[J].调味品，2012，37（11）：32-35.

　　[2]徐迪.酱菜中亚硝酸盐含量的测定及其对人体健康的影响[J].食品安全导刊，2018（9）：151-153.

　　[3]许丽娟，陈薇，吴迎奔，等.亚硝酸盐降解菌N419的培养基优化[J].湖南农业科学，2016（9）：10-11，16.

　　姜建1，吕腾1，李娇卓1，李宁1，王峰1，乔艺1，解瑞宁1，张春芝1，田书义2

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