用E.coli表达猪圆环病毒2型Cap蛋白生产病毒样颗粒

分类：论文范文 发表时间：2021-04-22 09:07

　　摘要：【目的】研究利用大肠杆菌可溶性表达PCV2b亚型ORF2基因，利用重组Cap蛋白制备PCV2VLP疫苗的可行性。【方法】根据大肠杆菌密码子使用频率表优化合成PCV2NJ株ORF2基因，将其插入原核表达载体pQZ1，鉴定阳性后转入表达宿主菌BL21，利用原核表达平台CVC1102对重组菌进行诱导表达。利用SDS-PAGE与Westernblotting对目的基因的表达及产物的可溶性进行分析；利用电镜分析技术鉴定重组Cap蛋白VLP组装；利用BCA试剂盒测定重组大肠杆菌破碎后上清中总蛋白量，利用薄层扫描分析确定目的蛋白百分比，得出目的蛋白量，将重组Cap蛋白的浓度调整为1mg·mL-1。使用不同剂量的重组蛋白与206佐剂乳化，免疫2—3周龄抗原抗体双阴性的仔猪，同时设含免疫增强剂CVC1301、CVC1302的试验组、同类制品免疫对照组与空白对照组，免疫后14d与21d所有试验猪采血，分离血清，利用武汉科前生物科技有限公司的猪圆环病毒2型抗体ELISA检测试剂盒检测试验猪血清中PCV2抗体水平；免疫后28d试验猪按照兽用生物制品质量标准汇编中公布的PCV2攻毒程序，利用PCV2NJ株F6代进行强毒攻击试验，肌肉注射与口服PCV2NJ株各105.0TCID50，同时利用乳化的钥匙孔血蓝蛋白及硫酸巯基乙醇培养基进行免疫刺激，攻毒后25d，对所有试验猪进行解剖检测，通过攻毒过程中试验猪体温变化、试验猪平均相对日增重、解剖时试验猪肺部与相关淋巴结的大体变化及攻毒后PCV2核酸检测等4个方面评价大肠杆菌表达制备的PCV2VLP的免疫效力。【结果】SDS-PAGE结果表明PCV2NJ株优化的ORF2基因在大肠杆菌中得到了高效表达，表达产物以完全可溶性形式存在于菌体超声波破碎后的上清中；Westernblotting分析结果显示表达的重组Cap蛋白能够与PCV2阳性血清发生反应；电镜下观察可见大量直径在17nm左右的PCV2病毒样颗粒存在于超声破碎后的上清中；500μg/头重组VLP疫苗免疫猪产生较高的抗体水平，单次免疫后21d抗体100%达到合格，对PCV2强毒的攻击提供完全保护。【结论】实现了PCV2Cap蛋白在大肠杆菌中高效可溶性表达，重组Cap蛋白体外自我组装成病毒样颗粒，且具有良好的免疫原性，可用于制备PCV2亚单位疫苗。

　　关键词：猪圆环病毒2型；ORF2基因；可溶性表达；病毒样颗粒；免疫原性

　　0引言

　　【研究意义】猪圆环病毒2型（Porcinecircovirustype2，PCV2）是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征的主要病原。自1991加拿大首次报道PMWS以来，该病现已波及世界各地，是全球公认的危害养猪业的重要传染病之一，在中国猪群中流行也十分严重[1-3]。尽管通过改善饲养环境、减少应激等因素可以避免感染猪出现临床征状，但不能完全抑制PCV2的感染，一旦外界因素改变，极易引起感染猪发病，给养猪业造成严重的损失[4-6]。因此，利用疫苗免疫预防是解决PCV2流行问题的关键[3]。【前人研究进展】由ORF2编码的核衣壳蛋白（Cap）是PCV2主要的免疫原性蛋白。已有研究发现Cap蛋白可自我组装成病毒样颗粒[7-8]。美国勃林格公司和法国英特威公司利用杆状病毒表达系统研究的Cap蛋白亚单位疫苗对猪有良好的免疫保护效果，已经商品化生产，但其价格昂贵[9-10]。Nawagitgul等利用杆状病毒表达系统表达了PCV2Cap蛋白，并把表达产物用作ELISA检测抗原及亚单位疫苗，在动物实验中取得良好的效果[11]；Sergio等[12]在酵母表达系统中表达了PCV2优化的Cap基因，表达产物可以自发组装成VLP，表达产物口服免疫小鼠产生了较高的抗体水平；Khayat等[13]在大肠杆菌表达系统中表达了删除N基端41个Aa的截短的PCV2Cap蛋白；Zhou等[14]将PCV2Cap蛋白与谷胱甘肽融合，在大肠杆菌中获得表达；Wu等[15]利用大肠杆菌表达了ΔFlage与全长Cap的融合基因，表达产物切除ΔFlage后，全长Cap蛋白在电镜下可见组装成VLP的颗粒，具有较好免疫原性，并且作者认为只有表达全长的Cap蛋白才能更好地形成VLP；Yin等[16]利用小泛素蛋白与Cap蛋白基因融合在E.coli中表达，表达产物切除小泛素蛋白后在电镜下可见20nm左右VLP颗粒；Kong与Liu等[17-18]在大肠杆菌与乳酸杆菌表达系统中表达了PCV2Cap蛋白，动物实验结果表明，重组Cap蛋白均有良好的免疫原性。【本研究切入点】目前商品化的PCV2基因工程亚单位疫苗都是利用杆状病毒表达系统表达的，杆状病毒表达系统具有真核表达系统翻译后修饰的优点，但是也有其缺点，如表达量低、疫苗生产成本高、周期长等缺点。Cap蛋白为核衣壳蛋白，不存在蛋白的糖基化与磷酸化，加之基因长度比较小[19]，如果能够在对基因进行合理的优化，选择合适的大肠杆菌表达系统的基础上，实现Cap蛋白在E.coli中的可溶性表达并组装成VLP，结合E.coli表达的低成本、高表达量、表达周期短等优点，对于PCV2基因工程亚单位疫苗的研究具有非常重要的意义。【拟解决的关键问题】实现PCV2Cap蛋白全长在大肠杆菌表达系统中的可溶性表达及表达产物的免疫效力评价，为研制安全有效的PCV2亚单位疫苗奠定基础。

　　1材料与方法

　　1.1试验材料

　　PCV2NJ株为b基因型的强毒株，由国家兽用生物制品工程技术研究中心在2008年分离鉴定、保存，利用PK15细胞增殖滴度可达106.0TCID50·mL-1，该病毒F3—F6代按照兽用生物制品质量标准汇编中公布的PCV2疫苗攻毒效检程序攻毒，可致50日龄左右的PCV2抗原抗体阴性仔猪明显的肺部与相关淋巴结病变（未发表资料）；PCV2NJ株ORF2基因的优化合成由上海英骏生物技术有限公司完成；原核表达平台CVC1102由国家兽用生物制品工程技术研究中心构建、保存；免疫增强剂CVC1301与CVC1302由国家兽用生物制品工程技术研究中心筛选，并且对FMDV灭活疫苗及PEDV灭活疫苗等多种抗原的免疫增强效果已经得到验证；商品疫苗为勃林格公司利用昆虫细胞表达生产的基因工程疫苗；限制性内切酶、T4DNA连接酶、PCR试剂及pMD18-T载体购于TaKaRa公司；质粒提取试剂及胶回收试剂盒为Axygen公司产品；DH5α感受态细胞购于北京BioMed公司；猪抗PCV2多克隆抗体购自美国VRDM公司；HRP标记羊抗猪抗体为KPL公司产品；实验动物购自江苏省丹阳市云立生态牧业有限公司，试验前利用ELISA试剂盒检测PCV2抗体，利用PCR法检测PCV2核酸，确保每头试验猪均为PCV2抗原抗体阴性，后续整个实验过程于2013年11月至2014年1月在江苏省农业科学院国家兽用生物制品工程技术研究中心实验动物房进行；用于检测PCV2抗体的间接ELISA试剂盒购自武汉科前生物科技有限公司；其余试剂均为国产或进口分析纯。

　　1.2优化的ORF2基因

　　片段的获得根据PCV2b亚型基因组中ORF2基因序列（GenBank登录号：KC153106.1），利用PrimerPremier5.0生物软件设计出一对特异性引物。利用SDS-PK法提取PCV2NJ株的DNA，以PCV2NJ株基因组为模板，扩增ORF2基因并测序；根据大肠杆菌密码子偏好，将扩增得到的基因进行密码子优化、合成，得到密码子优化的PCV2NJ株ORF2。为了便于基因的克隆，在密码子优化后的基因序列5′端和3′端分别添加了酶切位点NdeI与BamHI，优化的ORF2基因由上海英骏生物技术有限公司合成，克隆入pMD18-T载体，获得重组质粒pMD-Cap。

　　2结果

　　2.1目的基因优化

　　PCV2NJ株ORF2基因序列与设计引物的模板毒株（GenBank登录号：KC153106.1）核酸同源性为93.5%，氨基酸同源性为92.3%。对PCV2NJ株ORF2基因按照E.coli表达系统优化结果见图1。

　　2.2重组表达载体的鉴定

　　构建的重组质粒pQZ-Cap用NdeI与BamHI双酶切，酶切产物经1%的琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色后，在紫外线下可见约5000bp的载体片段和702bp大小的目的条带，与预期片段大小相符（图2）。

　　3讨论

　　猪圆环病毒2型与猪的多种疾病综合征有关，包括断奶仔猪多系统衰竭综合征、猪皮炎/肾病综合征、仔猪先天性震颤、母猪流产、猪增生性/坏死性肺炎等，严重危害养猪业的健康发展，其中研究比较深入的是断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）[20]。PMWS已遍布世界各个养猪国家，其危害已经被人们所认识。尽管通过改善饲养环境、减少应激等因素可以避免感染猪出现临床症状，但不能完全抑制PCV2的感染，一旦外界因素改变，极易引起感染猪发病，给养猪业造成严重的损失，因此，预防是解决PCV2感染问题的关键[21]。血清学分析表明PCV2可以诱导体液免疫，长期的被动免疫可以抵抗PCV2的感染和减轻PMWS的症状，因此疫苗免疫是防制PCV2感染的有效手段之一[22]。PCV2生物学特性比较特殊，它在细胞上增殖滴度很低，不引起细胞病变，而且PCV2的病毒DNA存在免疫抑制，使用D-氨基葡萄糖处理细胞后病毒滴度可以升高，但D-氨基葡萄糖有细胞毒性而使细胞很快死亡，因此发展传统的灭活疫苗和弱毒疫苗的难度很大[23-26]。VLP疫苗是利用表达系统大量表达病毒的相关保护性抗原，在体外组装而成。由于VLP疫苗只含有病毒衣壳蛋白，不含核酸，不仅具有很高的安全性，而且便于规模化生产，是具有应用前景的新一代疫苗之一[27-30]。

　　4结论

　　本研究利用大肠菌表达系统获得PCV2病毒样颗粒制备的亚单位疫苗具有良好的免疫原性，单次免疫猪体后可以降低发病率，增加日增重，减轻发病症状，清除或减少血液和组织器官中的病毒，对猪体具有明显的保护作用。从本研究的结果来看VLP疫苗是一个具有良好发展前景的PCV2亚单位疫苗。

　　References

　　[1]AllanGM,EllisJA.Porcinecircoviruses:areview.JournalofVeterinaryDiagnosticInvestigation,2000(12):3-14.

　　[2]AllenGM,McNeillyF,CassidyJP,ReillyGAC,AdairB,EllisWA,McNultyMS.Pathogenesisofporcinecircovirus;experimentalinfectionsofcolostrumdeprivedpigletsandexaminationofpigfoetalmaterial.VeterinaryMicrobiology,1995(44):49-64.

　　[3]ChaeCA.reviewofporcinecircovirus2-associatedsyndromesanddiseases.VeterinaryJournal,2005(169):326-336.

　　赵晓云1,2，乔绪稳1，陈瑾1，李鹏成1，于晓明1，朱国强2，郑其升1，侯继波1

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