白菜NPF基因家族成员的鉴定及其生物信息学分析

分类：论文范文 发表时间：2021-08-17 10:10

　　摘要：NPF基因家族是植物体内普遍存在的硝酸盐转运蛋白，同时负责硫苷、多肽、钾盐、植物激素等物质的运输。为了明确白菜NPF基因家族的功能和进化关系，利用生物信息学方法鉴定了白菜的NPF基因家族成员，并对NPF基因家族蛋白进行了理化性质、二级结构、亚细胞定位、保守基序分布以及与拟南芥的进化关系分析，对白菜NPF基因家族成员进行了基因结构以及染色体定位分析。结果表明，白菜NPF基因家族共有72个成员，编码蛋白的氨基酸数量在497~1117个，分子质量在54.49~123.21ku，等电点在5.72~9.47，大部分为稳定的碱性蛋白。二级结构以α-螺旋为主，其次是无规则卷曲，亚细胞定位预测均在质膜上。系统进化树将白菜NPF基因家族蛋白分为8个亚族，其保守性较高。白菜NPF基因家族成员大部分含有4个CDS序列。72个NPF基因家族成员不均匀地分布在白菜10条染色体上。

　　关键词：白菜；NPF基因家族；生物信息学；理化性质；保守基序

　　硫代葡萄糖苷又称硫苷，主要存在于白菜、甘蓝、萝卜、拟南芥[1]等十字花科[2]植物中。硫苷不仅是植物主要的防御化合物[3]，对人体健康也有重要影响[4]。氮是构成硫苷的重要成分，也是植物生长发育所必须的元素[5]。植物吸收氮素以硝态氮为主，且吸收、转运过程均依赖硝酸盐转运蛋白[6]。这类转运蛋白主要包括硝酸盐转运蛋白1（Nitratetransporter1，NRT1）、硝酸盐转运蛋白2[7]（Nitratetransporter2，NRT2）、氯酸盐通道蛋白（Chloridechannei，CLC）以及慢离子相关通道同系物（Slowanionchannel-As-sociatedHomologs，SLAC/SLAH）[8]。

　　1材料和方法

　　1.1白菜NPF基因家族的鉴定及理化性质分析

　　从Pfam数据库中获得NPF基因家族结构域（PF00854）的HMMprofile文件，利用HMMER3.0对拟南芥、白菜的全基因组进行搜索，设置E值为10-5，得到上述2个物种的候选基因，获取其蛋白序列和基因序列的FASTA格式。利用NCBI中的CDD和SMART数据库对候选基因的蛋白结构域进行检测，删除含有NPF结构域但不完整的基因序列或者不含NPF基因家族结构域的基因序列[21]。利用在线软件ExPASy（https://www.expasy.org/）对筛选出的白菜NPF基因家族蛋白序列进行氨基酸数量、分子质量、等电点、不稳定系数和原子总数等理化性质分析[22]。

　　1.2基因家族系统进化树分析

　　利用MEGA7.0软件对白菜和拟南芥NPF基因家族蛋白序列进行比对，采用NJ法（Neighbor-joining）构建进化树[23]，利用在线软件iTOL（https://itol.embl.de/）对进化树进行简单修饰。

　　2结果与分析

　　2.1白菜NPF基因家族蛋白理化性质分析

　　通过HMMER3.0以及BLAST在白菜基因组中找到99个NPF基因家族成员，通过NCBI中的CDD和SMART数据库比对删除含有NPF结构域但不完整的基因序列或者不含NPF基因家族结构域的基因序列后，留下72个明确属于NPF基因家族的基因（表1）。对白菜NPF基因家族蛋白理化性质分析的结果表明，白菜NPF基因家族蛋白在氨基酸数量、分子质量、等电点、原子总数、不稳定系数、脂肪系数以及亲水性方面均存在差异。白菜NPF基因家族蛋白序列中氨基酸的数量为497~1117个，73.61%的白菜NPF基因家族成员的氨基酸数量介于500~600个。白菜NPF基因家族蛋白序列的分子质量为54.49~123.21ku，与氨基酸数量变化趋势一致。白菜NPF基因家族蛋白序列的等电点在5.72（Bra024838）~9.47（Bra035886），72个白菜NPF基因家族蛋白中有63个蛋白的等电点大于7.5，说明白菜NPF基因家族蛋白大部分属于碱性蛋白。不稳定系数小于40即为稳定蛋白，NPF基因家族蛋白中有10个蛋白序列不稳定系数大于40，属于不稳定蛋白，剩余的均为稳定蛋白。白菜NPF基因家族蛋白序列的脂肪系数在88.79（Bra010165）~113.74（Bra008009）。其中，脂肪系数大于100的有38个。白菜NPF基因家族蛋白亲水性均为正值，说明其皆为疏水蛋白。

　　2.2拟南芥与白菜NPF基因家族蛋白系统进化树分析

　　将鉴定到的72个白菜NPF基因家族蛋白序列与拟南芥53个NPF基因家族蛋白序列合并构建系统进化树，依据同源关系将白菜NPF基因家族分为8个亚族（图1）。其中，NPF1与NPF2亚族进化关系近，亲缘性高。NPF5亚族中包含的NPF基因家族的成员最多，有26个白菜NPF基因家族成员。NPF3亚族在拟南芥中只有1个基因，在白菜中筛选到2个基因。NPF6与NPF4在同一个分支上，说明这2个亚族亲缘关系较近。NPF7和NPF8的亲缘关系较近。

　　3结论与讨论

　　NPF基因家族在植物体生长发育过程中必不可少，其家族成员不仅可以调控氮元素的吸收、运输以及再利用过程[9]，还可以调控硫苷的空间分布以保护植物免受昆虫的危害。本试验通过对比拟南芥NPF基因家族，在白菜鉴定出72个NPF基因家族成员，多于拟南芥NPF基因家族中的53个成员，少于苹果NPF基因家族中的73个成员[27]。水稻NPF基因家族成员的数量目前是最多的，有93个成员，上述结果表明白菜基因组的复制和多样化高于拟南芥，低于水稻和苹果。

　　本研究结果表明，白菜NPF基因家族有72个成员，白菜NPF基因家族蛋白的氨基酸数量在497~1117个，其中73.61%的白菜NPF基因家族成员的氨基酸数量介于500~600个。白菜NPF基因家族蛋白序列的等电点大于7.5的有63个，多在碱性范围，说明白菜NPF基因家族蛋白富含碱性氨基酸。白菜NPF基因家族蛋白均为稳定的疏水蛋白。对白菜NPF基因家族蛋白序列进行二级结构及亚细胞定位预测的结果表明，白菜NPF基因家族蛋白均以α-螺旋为主，α-螺旋占比在50%以上的基因有18个。其次为无规则卷曲，含量最少的为β-转折。白菜NPF基因家族蛋白均定位于质膜。杨林[28]、江定[29]分别对甘蓝型油菜、芥蓝的NPF2.10和NPF2.11蛋白进行了鉴定及亚细胞定位分析，结果也均定位在质膜上，与本研究结果一致。对白菜NPF基因家族成员进行基因结构分析，发现该基因家族大部分基因含有4个CDS区域，孔伟伟[11]对分析花生NRT1基因家族成员进行分析，发现大部分基因也含有4个CDS区域，苹果NPF基因家族成员大部分也含有4个CDS区域[27]。

　　系统进化树分析结果表明，白菜NPF基因家族蛋白可按同源关系远近分为8个亚族，分别为NPF1、NPF2、NPF3、NPF4、NPF5、NPF6、NPF7、NPF8。每个亚族的成员数量都各不相同，这与其功能及进化的复制和丢失有关[30]。同一家族的蛋白保守基序较为相似，说明具有相同的功能[31]。苹果NPF基因家族成员在根、叶、茎、花和果实中表达，但是在特定的组织当中，不同的发育阶段其表达量也有差异[27]。目前，白菜NPF基因在不同部位及不同发育阶段的表达情况未知，下一步将深入研究白菜NPF基因在不同部位及发育阶段的表达情况，解析其与硝酸盐以及硫苷转运之间的关系，为深入研究植物体内转运蛋白奠定基础。

　　参考文献：

　　[1]张园园.油菜和拟南芥中几个硫代葡萄糖苷合成及调控基因的功能分析[D].武汉：华中农业大学,2015.ZHANGYY.FunctionanalysesofseveralgenesinvolvedinbiosynthesisandregulationofglucosinolateinBrassicanapusandArabidopsisthaliana[D].Wuhan：HuazhongAgriculturalUniversity，2015.

　　[2]雷建军，陈长明，陈国菊，等.硫苷及其生物合成分子生物学机理研究进展[J].华南农业大学学报，2019，40（5）：59-70.LEIJJ，CHENCM，CHENGJ，etal.Progressinglucosinolatesanditsmolecularmechanismofbiosynthesis[J].JournalofSouthChinaAgriculturalUniversity，2019，40（5）：59-70.

　　[3]秦晗，张文姗，王猛，等.四个芸薹属物种硫苷含量与种类分析及特殊硫苷成分的种间导入[J].植物遗传资源学报，2020，21（1）：94-104.QINH，ZHANGWS，WANGM，etal.Characterizingglucosinolatesoffourbrassicaspeciesandinterspecifictransferringofspecifificglucosinolates[J].JournalofPlantGeneticResources，2020，21（1）：94-104

　　马嘉俊，吴英华，李璿，李梅兰，侯雷平

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