水果果实中主要有机酸提取条件的优化

分类：论文范文 发表时间：2021-04-14 09:37

　　摘要：【目的】建立一种能同时测定水果果实中主要有机酸（柠檬酸、酒石酸、苹果酸、琥珀酸）含量的有效提取方法。【方法】以柑橘、葡萄等为试材，以乙醇的水溶液为提取剂，采用超声提取的方法，对提取剂提取效果（乙醇溶液浓度配比、纯水提取效果及主要有机酸的稳定性、不同浓度乙醇溶液提取效果、10%乙醇溶液提取效果及主要有机酸的稳定性等）、提取条件（提取方式、超声提取时间等）进行优化试验研究。用优化的提取方法对方法技术参数（检出限、精密度、重复性、准确度等）进行测试，并将测定结果与已有国标法测定结果进行比较分析。【结果】水果果实中有机酸提取的适宜方法为乙醇溶液超声提取法：样品用10%乙醇溶液在超声波提取器中提取30min，提取后加入硫酸溶液，使提取液中含有和流动相一致的硫酸质量浓度，然后用10%乙醇溶液定容，混匀后离心过滤。取部分滤液用0.22μm水性滤膜针头过滤器过滤，供离子色谱分析用。在此条件下，主要有机酸提取完全，且提取液在室温条件下稳定性好，至少在15d内各主要有机酸不会转变为乳酸和乙酸。优化后的提取方法精密度高（RSD为0.28%—1.20%），重复性好（变异系数为0.236%—3.02%（n=5）），准确度高（回收率为88.9%—101.2%），有机酸组分测定效果优于已有国标测定结果。【结论】该方法快速、简便，准确度高、重现性好，适合水果果实中主要有机酸含量的测定。

　　关键词：水果；有机酸；乙醇；提取；离子色谱

　　0引言

　　【研究意义】有机酸通常是指分子结构中含有羧基（-COOH）的具有酸性的有机化合物。水果果实中相当一部分干物质是有机酸，它往往比许多其他物质更多地决定水果的特殊味道，并在食品营养学中占有重要位置。有机酸组分与含量是果实品质风味的重要组成因子，植物体内积累的有机酸还参与了光合作用、呼吸作用以及氨基酸、酚类、酯类和芳香类物质合成等代谢过程[1]，因而研究水果中主要有机酸的有效提取方法意义重大。【前人研究进展】水果果实中有机酸种类及含量高低是内在遗传特性、外在自然环境和栽培措施等因子共同作用的结果。水果果实中主要有柠檬酸、苹果酸、酒石酸、琥珀酸等有机酸，不同种类的水果中有机酸的种类和含量差异很大。目前针对果实中有机酸种类与含量报道较多，安华明等[2]研究结果表明刺梨果实中主要有机酸为苹果酸、酒石酸，柠檬酸、琥珀酸、草酸含量较少；Sturm等[3]研究了草莓成熟果实中主要有机酸成分，罗安才[4]和Silva[5]等研究了柑橘，Bartolozzi等[6]研究了杏，Wu等[7]研究了桃，Glew等[8]研究了欧楂等果实中有机酸组分含量。目前有机酸提取方法有多种，如霍月青等[9]采用80%甲醇溶液在70°C恒温水浴条件下提取样品中有机酸，加入内标α-D葡萄糖苷浓缩干燥后用盐酸羟胺溶液溶解，再加入六甲基二硅胺烷和三甲基氯硅烷后于70°C下加热2h，然后采用GC-FID分析方法对不同品种砂梨中有机酸含量及发育期变化进行了研究；罗晶等[10]采用在索氏提取器中用乙醚进行提取，过滤水浴蒸干后再用甲醇溶解，用液相色谱的方法对车前草中不同有机酸组分进行了分析；何志刚等[11]采用0.2%偏磷酸冰浴研磨提取研究了枇杷果实中有机酸的代谢；崔婧等[12]用0.8%磷酸在室温下提取后用反式高效液相色谱法测定的方法研究了葡萄中有机酸的测定条件；田林锋等[13]采用纯水冷浸超声提取的方式分析了梨中柠檬酸、苹果酸等有机酸组分含量；刘娣等[14]对Harmens等[15]提取有机酸的方法进行了改进，采取样品冻干后用80%乙醇溶液浸泡过夜后在75°C水浴条件下提取30min的方法，分析了缺锌条件下苹果根系中有机酸的变化；鲁旺旺等[16]采用酶解辅助乙醇浸提法测定了青梅中的有机酸含量。【本研究切入点】由于水果果实组分复杂，糖、色素、乙醇以及多酚等组分都可能对有机酸的测定造成干扰；另外，有机酸提取中使用的甲醇、乙醚具有一定的毒性，酶法辅助提取条件不易控制，因此，有必要建立一种稳定的、适用于水果果实中有机酸分析的提取方法。而且有机酸能否提取完全、提取后有机酸是否稳定有待进一步研究。【拟解决的关键问题】以柑橘、葡萄、苹果、桃、草莓、哈密瓜为试材，以乙醇的水溶液为提取剂，采用超声提取的方法，旨在建立一种快速、简便、准确的水果果实中主要有机酸的提取方法，为水果中有机酸的测定方法国家标准提供理论依据，为水果果实品质研究以及不同用途品种选择和育种提供参考。

　　1材料与方法试验于2013年1—4月在中国农业科学院郑州果树研究所进行。

　　1.1材料与试剂

　　1.1.1材料以柑橘、葡萄、苹果、桃、草莓、哈密瓜6种水果为试材，样品来自大型超市。

　　1.1.2试剂对照品柠檬酸（CDCT-C11668515）、酒石酸（CDCT-C17137800）、苹果酸（CDCT-C14730500）、琥珀酸（CDCT-C16985000），纯度98%以上。乙醇为色谱纯，其他试剂均为分析纯。

　　1.2仪器与设备

　　离子色谱仪（861，电导检测器），瑞士万通公司；超声波提取器；超纯水器；0.22μm水系针式滤器；天平。

　　2结果

　　2.1提取和净化条件的优化

　　2.1.1提取剂种类的选择常用提取剂主要有甲醇、乙醚、磷酸、偏磷酸、乙醇、纯水等，鉴于甲醇、乙醚具有一定的毒性，而用磷酸、偏磷酸提取时会因提取液中酸根阴离子的存在而影响有机酸的分离测定，因而选择乙醇和纯水作为提取剂，对提取条件进行优化。

　　2.1.2提取剂浓度配比的确定

　　2.1.2.1纯水提取效果及主要有机酸的稳定性以柑橘、葡萄、草莓、桃、苹果等样品为试材，对常用提取剂水和乙醇进行了比较试验。图2为柑橘样品用水做提取剂时各种有机酸含量随时间推移的变化情况，可以看出，在仅用水做提取剂时，柑橘样品提取液中柠檬酸和苹果酸含量下降很快，而乳酸和乙酸则随时间延长而急剧增加。比如，以提取后立即上机测定为对照，柠檬酸和苹果酸在提取后2h上机分别降低了19.3%和27.4%，在提取后4h上机分别降低了22.7%和31.1%，在提取后24h上机，柠檬酸降低了96.3%，而苹果酸则基本检测不出了。相应的在提取后2h上机时，即有乳酸和乙酸检出（含量分别为0.143、0.061g·L-1），在提取后4h上机乳酸和乙酸含量分别为0.364、0.0788g·L-1，在提取后24h上机乳酸和乙酸浓度分别高达18.8、5.24g·L-1，在提取后30h上机乳酸和乙酸浓度分别高达28.2、9.05g·L-1。葡萄、草莓、桃、苹果等样品测定结果也类似，说明在没有防腐剂等存在下，可能由于乳酸菌的存在而产生苹果酸-乳酸发酵作用，使得样品中苹果酸等逐渐转变为乳酸和乙酸，因而仅用水做提取剂来提取水果中有机酸是不可行的。

　　2.1.2.2不同浓度乙醇溶液提取效果

　　选用酒石酸含量很高、其他有机酸组分含量也相对较高的葡萄为主要试材，针对不同浓度的乙醇溶液做提取剂进行试验。图3为葡萄样品用乙醇的水溶液做提取剂时各有机酸组分含量的测定结果。可以看出，随着乙醇浓度的增加，葡萄样品中酒石酸含量急剧降低，以10%乙醇溶液提取时酒石酸含量（3.79g·kg-1）为基础，以35%乙醇溶液和50%乙醇溶液提取时酒石酸含量分别降低了11.9%和18.7%，以60%乙醇溶液和70%乙醇溶液提取时酒石酸含量分别降低了23.2%和37.7%，以80%乙醇溶液和90%乙醇溶液提取时酒石酸含量分别降低了75.4%和91.8%。葡萄中柠檬酸和苹果酸含量变化也类似，也表现为用10%乙醇溶液提取时含量最高（分别为0.231、2.10g·kg-1），用35%—90%的乙醇溶液为提取剂时，柠檬酸和苹果酸含量降幅分别为（6.7%—26.2%）、（9.5%—22.9%）。这可能是由于酒石酸在乙醇中的溶解度较低（25°C时乙醇中溶解度为50g·L-1，而水中溶解度为1390g·L-1），苹果酸在乙醇中溶解度也低于在水中溶解度（DL-苹果酸25°C时的溶解度水中为580g·L-1、乙醇中为390g·L-1），用高浓度乙醇提取有机酸时酒石酸和苹果酸提取不完全的缘故，因此，用高浓度的乙醇溶液做提取剂也是不可取的。

　　2.2方法技术参数

　　2.2.1方法检出限

　　根据GB/T5009.1-2003（附录A检验方法中技术参数和数据处理），对仪器检出限进行了测试，本方法检出限柠檬酸为0.0005g·L-1，酒石酸、苹果酸、琥珀酸均为0.0002g·L-1。如果按称样量为5g、定容体积100mL折算，固体样品含量即方法检出限柠檬酸为0.01g·kg-1，酒石酸、苹果酸、含量Content(g·kg-1)图6有机酸组分含量随超声提取时间变化情况Fig.6Organicacidscontentvariationwithultrasonicextractiontime琥珀酸为0.004g·kg-1。

　　2.2.2方法精密度试验[18-19]

　　吸取有机酸混合标准溶液，按1.3.3的色谱条件连续测定11次，计算每次的峰面积，根据测定结果计算相对标准偏差RSD。柠檬酸、酒石酸、苹果酸、琥珀酸相对应的RSD分别为0.87%、1.2%、0.28%、0.59%，表明该方法精密度良好。

　　3讨论

　　有机酸是水果果实中主要的营养风味物质之一，影响水果口感及生物稳定性，其主要组分和含量高低与水果品质密切相关，同时还是水果成熟度、耐贮性以及加工性的判断依据。由于水果果实组分复杂，乙醇、色素、多酚以及糖等组分都可能对有机酸的提取测定造成干扰。本试验采用10%乙醇溶液超声提取，既避开了使用甲醇[9]、乙醚[10]等有毒的有机溶剂，也避免了使用磷酸[12]、偏磷酸[11]为提取剂时提取液中阴离子酸根存在的干扰。同时提取液中含有的10%乙醇，抑制了乳酸菌等的产生，也避免了提取液中苹果酸因苹果酸-乳酸发酵（MLF反应）而分解成乳酸的过程，这就更能真实的反映出水果果实中原有的有机酸组分和含量，提取液中有机酸组分和含量至少在15日之内是稳定的，这也解决了个别试验条件差的实验室提取液存放的问题。本方法的提取效果优于已有标准《食品中有机酸的测定》（GB/T5009.157-2003），测定结果明显高于已有国标测定结果，尤其是以酒石酸和苹果酸为主的葡萄样品，与国标法相比酒石酸和苹果酸分别高了64.7%和46.3%。这可能是由于国标方法前处理过程是用80%乙醇提取，而酒石酸在乙醇中的溶解度很低，苹果酸在乙醇中溶解度也低于在水中溶解度的缘故。

　　4结论

　　用10%乙醇溶液在超声波提取器中提取30min，再加入1mL0.5mol·L-1硫酸溶液，然后用10%乙醇溶液定容，混匀后离心过滤，取部分滤液用0.22μm水性滤膜针头过滤器过滤，能同时用离子色谱法测定水果果实中主要有机酸组分。经方法学验证，各种有机酸组分精密度、准确度高，重现性好，该提取方法快速、简便，适合水果中主要有机酸组分含量的测定。

　　References

　　[1]曾骧.果树生理学.北京:中国农业大学出版社,1992:186-273.ZengX.FruitPhysiology.Beijing:ChinaAgriculturalUniversityPress,1992:186-273.(inChinese)

　　[2]安华明,刘明,杨曼,樊卫国.刺梨有机酸组分及抗坏血酸含量分析.中国农业科学,2011,44(10):2094-2100.AnHM,LiuM,YangM,FanWG.AnalysisofmainorganicacidcompositionsinRosaroxburghiiTratt.ScientiaAgriculturaSinica,2011,44(10):2094-2100.(inChinese)

　　[3]SturmK,KoronD,StamparF.Thecompositionoffruitofdifferentstrawberryvarietiesdependingonmaturitystage.FoodChemistry,2003,83:417-422.

　　庞荣丽，方金豹，郭琳琳，谢汉忠

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