不同栽培基质配方对银耳胞外酶活性的影响

分类：论文范文 发表时间：2022-04-20 11:09

　　摘 要：为探明不同栽培基质配方对银耳胞外酶活性的影响，以棉籽壳和木屑原料为对照，利用鲜绿洲1号、鲜巨菌草等菌草为主要原料工厂化栽培银耳，比较不同配方银耳不同生長期胞外酶活性。结果表明：银耳在不同栽培基质下羧甲基纤维素酶、滤纸纤维素酶、淀粉酶、漆酶和木聚糖酶等胞外酶活力大小为棉籽壳(C1)>鲜绿洲1号(L1)>鲜巨菌草(J1)>木屑(C2)，以鲜菌草为原料工厂化栽培银耳的营养基质利用能力强于木屑，鲜菌草可以替代木屑作为原料工厂化栽培银耳。

　　关键词：银耳;鲜菌草;胞外酶

　　银耳Tremella fuciformis Berk，是一种食药同源的大型真菌[1-2]，可段木栽培和代料栽培。以棉籽壳为原料栽培银耳，虽然产量高，其质量不如段木或木屑银耳[3-5]，可能产生农药残留[6]及棉酚危害[7-9]等问题，导致银耳价格较低;以木屑为原料栽培银耳，品质较好，产量比棉籽壳栽培的低，但由于林木的再生能力弱，多地限制砍伐树木用于栽培菌类，严重制约了银耳产业的可持续发展[5]。1986年福建农林大学发明了菌草技术[10]，利用五节芒、芦苇、巨菌草、类芦等干菌草栽培食药用菌，并初步探索出菌草栽培银耳技术[11-13]。传统食用菌理论认为，腐生菌类所需的营养物质来自已经死亡的及无生活力的有机物，只能从枯死的木本和草本植物中吸收营养并形成子实体，活性植物细胞具有抗性，且含水量高达90%以上，菌丝无法生长，原料干燥目的是杀死植物细胞，使其生理含水量降低。本研究旨在探讨利用未经干燥的鲜菌草栽培银耳[1，4]。

　　银耳的生长离不开对栽培基质中营养物质的利用，木质纤维素、淀粉等物质是食用菌生长的主要能量来源[14]，但它们不能直接被菌丝吸收利用。食用菌通过分泌胞外酶，把木质纤维素分解成可被菌丝吸收的小分子碳水化合物，进而为菌丝的生长提供能量[15]。胞外酶的活力可以反映出菌丝在不同时期对栽培基质的利用情况，本研究以棉籽壳和木屑原料作为对照，以鲜绿洲1号Arundo Donax Lvzhou No.1、鲜巨菌草Pennisetumgiganteumz.x.lin为主要原料工厂化栽培银耳，通过比较不同配方工厂化栽培银耳的胞外酶在不同时期的变化规律，分析银耳生长过程中对不同栽培基质的利用情况，了解鲜菌草配方与棉籽壳或木屑配方对营养物质利用的差异，为鲜菌草工厂化栽培银耳配方优化及其生产工艺提供依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 供试菌株

　　银耳XY04(A4)菌株，由福建省祥云生物科技发展有限公司提供。

　　1.2 栽培配方

　　L1：鲜绿洲1号54%，棕榈仁粕20%，莲子壳10%，麦麸14%，石膏1%，石灰1%;J1：鲜巨菌草54%，棕榈仁粕20%，莲子壳10%，麦麸14%，石膏1%，石灰1%;C1：棉籽壳71%，麦麸28%，石膏1%;C2：木屑71%，麦麸28%，石膏1%。

　　按比例称取原料，投入搅拌机中加入适量水，搅拌40 min，控制含水率在58%左右，拌匀后装瓶，每瓶装料560 g，打孔封口，于灭菌锅中灭菌6 h，移入无菌房，冷却后接种。

　　1.3 工厂化栽培条件

　　接种后的栽培瓶移入养菌房中，保持温度20～23℃，相对湿度80%～85%，25 d后，栽培瓶开盖，移入出菇房中，控制温度23～25℃，相对湿度80%，待耳片舒展时湿度控制在90%，于采收前5 d降低室内湿度，42 d时进行采收。

　　1.4 样品收集

　　接种后，各配方每6 d取样一次，每次取3瓶作为生物学重复，共取样7次。取出栽培料后，搓碎拌匀，取100 g栽培料，用液氮速冻后于-80℃冰箱中保存备用。

　　1.5 胞外酶活性测定

　　1.5.1 粗酶液制备 称取10 g解冻后的栽培料，研磨后移入三角瓶中，加入50 mL 蒸馏水，于25℃恒温振荡培养箱中150 r·min-1浸提90 min，浸提液用双层纱布进行过滤，滤液用蒸馏水定容至50 mL，9000 r·min-1离心15 min，上清液即为粗酶液。

　　1.5.2 羧甲基纤维素酶活性测定 向试管中依次加入预热的粗酶液0.5 mL和1% C8H11O5Na溶液1 mL，以煮沸灭活的粗酶液为对照组，于50℃水浴30 min。迅速加入DNS溶液1.5 mL，沸水浴反应7 min，立即用流水冷却，用蒸馏水定容至10 mL，于540 nm处测定吸光度值。酶活力单位的定义为：在50℃、pH 4.5的条件下，1 min水解底物生成1 μg葡萄糖为1个酶活力单位

　　U[16]。

　　1.5.3 滤纸纤维素酶活性测定 向试管中加入预热的粗酶液0.5 mL和CH3COONa缓冲液(pH 4.5)1 mL，再加入(50±0.5)mg滤纸1条(1 cm×6 cm)，以高温灭活的粗酶液为对照组，于50℃水浴1 h。立即加入DNS溶液1.5 mL，沸水浴反应7 min，立即用流水冷却，用蒸馏水定容至10 mL，于540 nm处测定吸光度值。酶活力单位的定义为：在50℃，pH 4.5条件下，1 mL酶液1 min水解底物生成1 μg葡萄糖为1个酶活力单位U[17]。

　　1.5.4 淀粉酶活力测定 取可溶性淀粉溶液4 mL于试管中，加入磷酸缓冲液1 mL，再加入0.5 mL粗酶液，以煮沸灭活的粗酶液为对照组，于50℃水浴30 min。取反应液1 mL，迅速加入盛有0.5 mL稀盐酸和5 mL稀碘液的试管中，于660 nm处测定吸光度值。酶活力单位的定义为：在60℃、pH 6.0条件下，1 min水解1 μg可溶性淀粉，定义为1个淀粉酶活力单位U[18]。

　　1.5.5 漆酶活力测定 取1 mmol·L-1 ABTS溶液0.1 mL于96孔板中，加入CH3COONa缓冲液(pH 4.5)0.15 mL，于30℃预热5 min，加入粗酶液50 μL，立即记录吸光度值，每隔30 s记录1次，共记录3 min。酶活力单位的定义为：在30℃、pH 4.5条件下1 min氧化1 μmolABTS所需酶量定义为1个酶活力单位U[19-20]。

　　1.5.6 木聚糖酶活力测定 取1% 木聚糖溶液0.75 mL于试管中，加入粗酶液0.25 mL，以煮沸灭活的粗酶液作为对照组，50℃保温30 min，立即向试管中加入DNS試剂1.5 mL，沸水浴7 min，流水冷却至室温，用蒸馏水定容至10 mL，于540 nm处测定吸光度值。酶活力单位的定义为：在50℃、pH 5.2条件下，1 min水解底物生成1 μg木糖所需的酶量定义为1个酶活力单位U[21]。

　　1.6 数据处理

　　使用SPSS 25软件进行数据分析，使用Origin 2021软件作图。

　　2 结果与分析

　　2.1 羧甲基纤维素酶活力变化

　　羧甲基纤维素酶是纤维素降解酶系的代表之一，该酶活力的变化能反映出银耳对栽培基质中纤维素的利用情况。由图1可知，不同配方随着栽培时间的增加，羧甲基纤维素酶活性呈现出先升高，后降低，再升高的过程，其中，第1次峰值，L1和J1出现在第24 d，且L1显著高于J1，C1和C2出现在第18 d，C1显著高于C2，但它们均在第30 d下降至最低值，C1显著高于J1，J1显著高于L1，L1显著高于C2。结合银耳的生长特性分析，在第24 d至30 d羧甲基纤维素酶活力的降低可能与银耳原基形成有关，在第30 d之后，子实体的生长需要消耗大量营养物质，因此酶活力迅速升高，为子实体提供足够的养分，从原基形成(第24 d)至子实体成熟(第42 d)，C1、 L1 、J1的羧甲基纤维素酶活力均显著高于C2。

　　2.2 滤纸纤维素酶活力变化

　　滤纸纤维素酶活力也是反应纤维素降解酶系的重要标志。由图2可知，滤纸纤维素酶活力随着栽培时间的延长，总体上呈现上升之后保持平稳的趋势。在菌丝生长第12 d，C1的酶活力显著高于其他配方，L1、J1、C2差异不显著。C2的滤纸纤维素酶活力在24 d后低于其他配方且差异显著，J1的酶活力波动较大，其他配方酶活力升高之后较为平稳。L1的酶活力均低于C1，但变化趋势与之相同。综合羧甲基纤维素酶和滤纸纤维素酶的数据来看，C1、L1、J1的纤维素酶活力均高于C2。

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