柱花草根际土著根瘤菌的丰度及其遗传多样性

分类：论文范文 发表时间：2021-06-24 10:13

　　摘要：为研究我国柱花草根际土著根瘤菌在不同生态环境土壤中的丰度及其遗传多样性，分别在海南、广西、广东、云南、四川等柱花草的主要分布区域采集土样及根瘤，通过MPN法测定得到各种土壤中土著根瘤菌的丰度，并从采集的根瘤中分离获得的55份根瘤菌菌株进行16SrDNA全序列分析，与相关参比菌株的16SrDNA序列进行比对及聚类。结果表明，我国柱花草主要种植区域土著根瘤菌含量差异较大，每克干土中含量为0.7×102～7.5×106个，海南儋州区域的含量最高，广东湛江南亚所区域的含量最低；所分离出的菌株都属慢生根瘤菌属（Bradyrhizobiumsp.），在系统发育树上聚合为8大类群，初步确定55株柱花草根瘤菌的亲缘关系及分类地位。

　　关键词：柱花草；根瘤菌；土著菌含量；16SrDNA；遗传多样性

　　柱花草[Stylosanthesguianensis(Aublet)Swartz]是一种兼饲料、绿肥、水保功能的放牧和刈割兼用的豆科(Fabaceae)牧草[1]。它具有适应性强、耐酸瘠土壤、耐干旱、耐粗放管理、产量高、品质好、粗蛋白及氨基酸[2]含量高等特性，是中国南方的主要豆科牧草，现已经广泛种植于海南、广西、云南、贵州、福建及四川的攀枝花干热河谷地区[3]。柱花草根系发达结合土壤中的土著根瘤菌形成大量的根瘤后固氮能力达225～300kg/(hm2·a)[4]，不但为植株本身及间作植物的生长提供氮素，还有改土培肥的作用。根瘤菌遗传多样性是指种内或种间分子、细胞和个体3个水平上的遗传变异，主要通过随机扩增DNA片段的多态性、基因外回文重复序列PCR扩增技术、限制性片段长度多态性分析、16SrDNA序列分析确定根瘤菌系统发育、随机扩增DNA片段多态性(RAPD)、DNAG+C摩尔百分含量测定及DNA-RNA杂交等分子技术进行确定。其中16SrDNA序列测定具有所包含的信息量大、更能反映根瘤菌的情况和操作较简单的特点，被国际细菌学会委员会推荐为确定根瘤菌系统发育地位的方法。在我国，对苜蓿、大豆等土著根瘤菌及其遗传多样的研究已经成熟并形成产品广泛用于生产中。但柱花草根瘤菌的研究情况国内很少有报道。为此，本项目组对中国种植柱花草的典型区域土壤中土著菌数量及根瘤菌遗传多样性进行调查，以期为柱花草的种植、开发利用柱花草根瘤菌资源及根瘤菌菌剂的施用等提供科学依据。

　　1材料与方法

　　1.1柱花草根际土著根瘤菌丰度的调查

　　1.1.1采样点的选择在广泛查阅资料的基础上，结合土壤及气候条件，选择海南(儋州、澄迈、东方、昌江)、广西(柳州百棚、扶绥牧草站、白色田阳)、广东(湛江南亚所、梅州丰顺)、云南(保山热经所、德宏农科站、思茅曼中田牧场、楚雄元谋)、四川(攀枝花)等种植柱花草的土壤进行土著根瘤菌的测定。

　　1.1.2土样采集均匀刮去土表杂物层，取0～30cm的土层土壤；每处取样3～5个点，充分混匀后在室温下风干，过120目筛备用。

　　1.2柱花草根瘤菌遗传多样性

　　1.2.1试剂及仪器培养基：TY培养基，配方为酵母提取物(Yeastextract)5g/L、胰蛋白胨(Tryptone)10g/L氯化钠(NaCl)5g/L，pH值在6.8～7.0[7]；YMA(YeastMannitolAgar)培养基参照文献[6]。试剂：E.Z.N.A.TMBacterialDNAKit试剂盒。提取过程所需试剂皆由试剂盒配备。引物由华南农业大学农学院谭志远老师设计、北京奥科生物技术公司合成。仪器：恒温摇床、分光光度计、eppendorf离心机、DK-8D型水槽、BiometraT1thermocyclerPCR仪、powerpactBasic电泳仪、Bio-RAD凝胶成像系统、FisherscientificVORTEXMIXER漩涡混匀器。

　　1.2.2根瘤菌菌株的来源所用的菌株均由热带农业科学院品种资源研究所从我国柱花草种植地采集分离得到(表1)。

　　2结果与分析

　　2.1柱花草土著菌丰度调查

　　中国种植柱花草的不同地域土著菌含量差异比较大(见表2)。其中海南儋州、海南东方、云南德宏农科所、云南元谋的含量最高达105个/g土，广东南亚所、云南保山热经所的土著菌含量最低仅为102个/g土。将土著菌的结果结合采样结果分析可以得知土著菌含量的较多的土壤都是种植年限比较久的柱花草种植地(表1)，而含量较低的云南保山热经所是新开的柱花草种植地。广西柳州百棚、广东湛江南亚所、云南思茅土壤中虽然有连续2年种植柱花草，但是土著菌含量也仅分别为1.1×103个/g土、0.7×102个/g土和2×102个/g土。结合土壤分析资料，土著菌含量少可能是由于这两地土壤都是酸性红壤(pH值小于4.6)，从而抑制了土著菌的生长。

　　2.216SrDNA的PCR扩增结果及其序列系统进化树构建

　　2.2.116SrDNA的PCR扩增结果部分菌株16SrDNA的PCR扩增结果电泳检测见图1。从图1可见，扩增条带明亮、无拖带，所扩增的16SrDNA是片段大小为1300bp左右的较纯的16SrDNA。

　　2.2.2菌株16SrDNA序列的系统进化树构建聚类分析表明：分离出的55个菌株中，菌株DH2-2、DF1、RJS6-1、CJ1、PN15-4、DH7-2和PN8-1之间的亲缘关系较近，但是未能和GenBank中选出的参比菌株聚到一类；菌株FS2-2、ZJ2-2回接检验结果为根瘤菌，但在聚类中和已知非根瘤菌菌株AY039015[Bacillussp.C3(2009)]、DQ81(Unculturedbacteriumcloneaaa98c10)亲缘关系最近。其余菌株皆与慢生根瘤菌亲缘关系较近，且不同的菌株之间亲缘关系有一定差异。根据慢生根瘤菌菌株在进化树上的表现可以分为8个类群(图2)：菌株PS5-1、PN15-3、BS2-3、DH10-3、NN1-2-1、DH12-1、PN14-1、FS3-1-1、PN1-1、NN1-1和BS1-1与菌株AY628222(Bradyrhizobiumsp.PAC40)亲缘关系最近可以聚合为第I类群；菌株DH1-1、LZ3-2、DH4-2、LZ2、DH3-1、LZ2-2和LZ2-1与菌株EF221626(Bradyrhizobiumsp.JR013)亲缘关系最近可以聚合为第II类群；菌株RJS2-3、RJS9-2和RJS12-1与菌株AB509380(Bradyrhizobiumyuanmingense)亲缘关系最近聚合为第III类群；菌株SM2-3、LY2-1、SM3-1、TJ、NN1-1-2、NN3-1、LY1、LY3、SM5-1和ZJ2-1与菌株EU364706(Bradyrhizobiumsp.SA1)以及AF384140(Bradyrhizobiumsp.PPlu1-11)亲缘关系最近可聚合为第IV类群；菌株YM11-1与菌株AY039015(Bradyrhizobiumsp.StrainORS3259)亲缘关系最近可聚合为第V类群；菌株DF5、DF2、DF3、DF6、DF4与菌株AF514703(Bradyrhizobiumsp.Aila-2)的亲缘关系最近可以聚合为第VI类群；菌株RJS9-1与菌株AY923031(Bradyrhizobiumsp.LMTR21)及FJ470(Unculturedbacteriumclonep7m17ok)亲缘关系最近，但是从培养情况和回接效果可以判断，RJS9-1和菌株AY923031的关系更为接近属于同一类，聚合为第VII类；菌株PN13-3、CM2、PS7-1、CM6、CM4、CM3、PS2-1-1、PS2-1与菌株EF601954(Bradyrhizobiumsp.Wall9)的亲缘关系最近，可聚合为第VIII类。

　　3讨论

　　（1）我国不同的柱花草种植区域土著根瘤菌含量差异较大，为每克干土0.7×102～7.5×106个。结合采样资料分析造成土著菌差异较大的原因是种植年限和种植地的土壤条件。一般情况下种植年限长、土壤pH值靠近7的土著菌含量高，但实际条件下是各影响因素综合影响土著根瘤菌含量。以往的研究结果表明，土著菌的含量主要与以下几个方面有关：①与种植史有关，种植过豆科植物的土壤中土著菌含量较多，而新开垦的没有生长过豆科植物的土壤中土著菌较少或几乎没有；②与土壤质地有关，质地好的土壤由于结构合理、营养成分富足等原因可以为根瘤菌提供更多的保护，因此根瘤菌的含量也较多。③和气候条件有关，Mahler等[8]研究结果表明，在北卡罗来纳地区土壤中苜蓿根瘤菌的数量在一年中不同的月份变化较大，较冷的季节根瘤的数量较多，4月份土壤中土著菌的含量达到最大，夏末秋初的土著菌含量则最少。从我国土壤中柱花草土著菌的含量来看，大部分区域的土著菌含量偏低，这表明我国柱花草种植需进行接菌是提高柱花草产量和品质的重要环节，同时还表明土壤中与高效菌株竞争的土著菌数量较少，高效菌就能占据较多的位点，有利于接种菌株占瘤率的提高。

　　（2）从我国柱花草分布区域分离出来的55份菌株，通过16SrDNA测序比对后确定为Bradyrhizobium属菌株，并且在系统发育上与相似的已知菌株分别聚在8个类群。从分布地域来看，除来自攀枝花、南宁、德宏、保山热经所的菌株分处2个类群外，其他同一来源的菌株都是聚在同一个类群，说明菌株在发育上具有较高的同源性，同时也存在一定程度的变异。

　　参考文献

　　[1]蔡小艳，赖志强.我国南方柱花草的利用现状及发展对策[A].2006草业发展论坛论文集[C].2006:157～161.

　　[2]白昌军，刘国道，王东劲，等.高产抗病圭亚那柱花草综合性状评价[J].热带作物学报，2004，25(2)：87-94.

　　[3]蒋昌顺.柱花草的研究进展[J].热带作物学报，2005，26(4)：104-108.

　　[4]易克贤.我国热带牧草产业化的发展现状、前景与对策[J].热带农业科学，2001(4)：30-34.

　　[5]MahlerRL,WollumAG.SeasonalvariationofRhizobiummelilotiinalfalfahayandcultivatedfieldsinNorthCarolina[J].AgronomyJournal,1982,74(3):428-431.

　　董荣书1,2，黄艳霞1,2，刘国道1*，廖红3

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