猪TLR4基因SNP位点筛选及生物信息学分析

分类：论文范文 发表时间：2020-06-24 10:18

　　摘　要：通过构建基因组DNA混合池对猪TLR4基因进行扩增和测序，并对其编码区的SNP位点进行筛选，运用生物信息学分析软件对猪TLR4基因的理化特性和编码蛋白质的二、三级结构进行预测。结果发现，在扩增的TLR4基因上没有发现SNP位点，猪TLR4基因片段一共编码118个氨基酸，其中缬氨酸(Val)最多，甲硫氨酸(Met)最少，编码产物不稳定指数大于40，说明编码产物具有不稳定性。编码蛋白质片段的亲水性平均值为0.385，说明该基因编码的蛋白质呈现疏水性，猪TLR4基因编码的蛋白质是一种不溶性蛋白质。研究结果为猪TLR4基因深入研究提供理论基础。

　　关键词：TLR4;猪;SNP位点;蛋白质;氨基酸

　　Toll样受体(TLRs)是动物体中重要的模式识别受体，在免疫细胞表层，例如淋巴细胞、树突状细胞、单核/巨噬细胞、粒细胞等广泛存在[1]，在非免疫细胞，例如上皮细胞、牛胚气管细胞等中具有较强的活性[2]。TLR4基因是20世纪末期才被发现的一种重要基因，属于TLRs受体家族的成员，具有一型跨膜蛋白结构，由胞内区、胞外区、跨膜区三个部分组成，胞外区具有大量的亮氨酸重复序列，组成了多肽链两个末端之一的N端。TLR4是脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)中比较典型的模式识别受体，在指导和编码合成细胞壁外膜内毒素成分时具有重要作用，与革兰氏阴性菌感染的致病机理具有密切联系。TLR4作为一种跨膜信号受体直接将脂多糖产生的刺激信号传入细胞内，是革兰氏阴性菌及其脂多糖进行宿主反应的重要媒介，与各种炎症因子基因的表达有关[3]。

　　1 材料和方法

　　1.1 采集样本

　　从猪种猪场通过随机抽样的方法选取大白猪、长白猪、杜洛克猪和八眉猪各50头，采集仔猪耳组织各约2 g，置于75%酒精中，-20℃冷冻保存备用。

　　采用试剂盒的方式提取不同样品猪种的DNA，并在0.8%琼脂糖凝胶电泳上进行DNA样品纯度的检测，并筛选提取效果良好的基因组DNA样品构建DNA混合池，即取50个DNA样品进行混合。

　　1.2 引物的设计与合成

　　参照GenBank上公布的猪TLR4基因序列(登录号：AB232527.1)，使用PrimerPremier5.0软件设计特异性引物。TLR4基因的引物设计F:5′-CGTCATTAGTGCGTCAGTTCTC-3′R:5′-GAGCCGATGGTGTATCTTTGAG-3′，引物由苏州金唯智生物科技有限公司合成。

　　2 结果分析

　　2.1 猪TLR4基因PCR扩增结果及测序结果

　　通过PCR扩增的方法对猪TLR4的基因片段进行检测，得到对应片段的测序结果。PCR扩增产物在1%琼脂糖凝胶电泳上进行检测，结果显示引物的特异性良好，PCR产物只有一条条带。基因片段的大小为353bp，电泳结果与预期结果相符(见图1)。

　　利用MEGA6软件、BioEdit软件将原基因序列与测序结果放在一起进行拼接和对比分析，并筛选SNP位点，结果显示猪TLR4基因片段中不含有SNP位点。

　　2.2 猪TLR4基因编码蛋白质理化性质的分析和预测

　　蛋白质的理化性质包括蛋白质的相对分子质量、半衰期、等电点等，通过Bioedit及Lasergene7.1软件对猪TLR4基因片段编码蛋白质理化特性进行分析(见表2)。猪TLR4基因片段一共编码118个氨基酸，缬氨酸(Val)最多，占整个氨基酸组成的12.7%，甲硫氨酸(Met)含量为0(见图2)。猪TLR4基因编码产物不稳定指数为50.67，大于40，所以说明该基因编码产物具有稳定性。

　　3 讨论

　　生物个体的表现形式由基因和外界环境共同决定[9]，进行猪抗病性状、生产性状的研究具有重要意义，现阶段受到商品化导向的影响，不同品种猪的抵抗力和体质都在下降，致使一些与抗病性有关的等位基因出现丢失[10]。TLR4基因是一种与免疫系统有直接联系的重要基因，研究表明基因多态性与动物对病原的免疫能力有关[11]。近些年，开展不同品种猪TLR4基因研究工作的人越来越多，主要集中于抗病性、多态性和免疫方面[12-15]。刘筱等[16]在研究过程中发现该基因编码蛋白质LRR(富含亮氨酸重复序列)功能域上的突变可能与猪种对疾病的易感性不同有关。王会敏等[17]对绵羊TLR4基因多态性与布鲁氏菌病易感性进行分析，发现TLR4基因只有1180 G/T位点可能与绵羊的布鲁氏菌病易感性有关。基于模板的蛋白结构预测计算预测蛋白质三维结构的重要方法是以模板为基础的蛋白质结构预测，具有快速、高准确性的特点[18,19]。本实验在进行蛋白质结构预测时借助同源建模的在线设计软件完成。

　　参考文献：

　　[1]彭帅,陈朗,郑天宇,等.大通牦牛TLR2基因SNP位点筛选及生物信息学分析[J].浙江农业学报, 2019,31(8):1280-1285.

　　[2]黄贺梅,尹晓燕.病原生物与免疫学临床案例版[M].武汉:华中科技大学出版社,2017.

　　[3]翟春媛.猪TLR4基因的突变与功能分析[D].哈尔滨:东北农业大学,2010.

　　作者：王馨敏，朱乔峰，马 越，秦雅晶，李之昂，刘丽霞

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